黄大昉：杀虫微生物农药生物技术研究进展

　　尊敬的各位代表、各位同学：非常高兴、非常荣幸能够参加这次科协年会的第八分会交流，我今天的报告题目是“杀虫微生物农药生物技术研究进展”，不过我想稍微改一下内容，因为我们后面那几位报告人，他们都会谈到，至少是杨怀文所长会谈到微生物农药问题，我想我还是就其中我自己研究的领域和大家说一下芽孢改良的问题。

　　不过我想稍微提一点生物农药的问题。很抱歉我很多的材料是最近在一个国际会议上的发言，所以我没有来得及完全转成中文，但是，我想在座各位英文水平都相当高，应该都能够理解。农业部在2004年有一个统计，我们国家的生物农药大概现在是这么几组数字：总产量是12万吨，占整个农药产量的（化学农药）12%；它的产值如果折算成美元是250万美元，在整个农药产值里占10%，目前产品大概有411个，在整个的农药产品总数量里占8%，涉及到生物农药的品种有140个，在整个农药的品种里占15%，应用面积现在是3亿公顷，在整个农药应用面积里面占9%，从这几组数字，我想大家可以有这样一个概念，大概生物农药在整个农药里是10%左右，占十分之一。当然生物农药包括微生物农药中，当然还有一些抗生素，还有一些植物原农药，但是今天我们主要谈的是微生物农药。

　　我们再看一下我们国内的微生物农药的情况。根据2005年农业部药检所的一个统计数字，我们在微生物农药里面BT的产品，就是苏云金芽孢杆菌制剂已经登记的是276个，占大部分。其它那几个是病毒农药，就是昆虫病毒，用来防治病虫害，还有“绿将军”农药，大概有2个。所以在300多个产品中，主要还是苏云金芽孢改进。还有一些，虽然没有正式登记，可是已经在生产和应用了。还有一些微孢子制剂，也在推广应用。现在回到我今天要谈的苏云金芽孢杆菌。

　　我想在座的一部分代表很熟悉苏云金芽孢杆菌，在它生长的过程里面，特别是伴随着芽孢的形成产生一种杀虫的有机体，苏云金芽孢杆菌最大的特点是除了杀虫以外，还非常安全，所以已经有了60多年应用历史，证明它是一种非常安全的、非常有效的微生物农药。

　　苏云金芽孢杆菌过去是作为一种制剂应用于虫害的防治，随着科学的不断进步，现在已经把苏云金芽孢杆菌杀虫基因蛋白结构和功能搞得比较清楚，也就是说在基因水平上已经对它有更多的了解，就是因为它中间有一种叫Gene基因，还有一种叫stability基因，它才有了对害虫的毒性。这些基因的结构，影响到它的本身，也影响到它的杀虫范围，当然大家知道，单一基因长期应用，也可能会引起抗体，所以这些问题，我们都可以通过基因进一步的分析得到解答。

　　这个是国外做的关于Creating3，它由三个主要的区域构成，对害虫的毒理和杀虫范围以及基因体的形成。很自然人们就会想到，既然我已经知道了它的蛋白、它的基因的结构，我有没有可能对苏云金芽孢杆菌进一步进行遗传改良，从80年代起，这方面有了很大的进展，通过遗传改良，我们可以提高它的杀虫能力，扩大它的杀虫范围，这样的话，我们就需要克隆很多新的苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的基因。

　　还有一个办法是可以把基因组合在一起，通过基因的组合，可以改善它的毒理和扩大它的杀虫组织，也可以起到延缓抗性的作用。同时人们还想到，改良后的苏云金芽孢杆菌的基因，可以再把它再做成制剂，在微生物里面表达，也可以把它转移到植物和作物里，让它表达抗虫性。

　　下面我想就我们自己研究的一些情况，结合国内、国外的某些方面的一些进展，给大家作一个介绍，就是看苏云金芽孢杆菌，我们怎么来操作它的基因，怎么进行遗传改良。

　　在这方面，由于我们国家的重视，这几年在苏云金芽孢杆菌的一些基因发掘上，我们取得了非常好的进展。请大家看这个表，在1997年以前，我们中国人没有分离、克隆自己的基因，我们用的基因都是国外的。可是从1997年起，华中农业大学第一个分离、克隆了我们中国人自己发现的一个基因。到了2006年8月份，也就是到上个月为止，我们检索了一下，全世界总共在这个期间发现了207个新基因，其中中国就占了67个，超过了整个同期发现新基因的四分之一。这个速度是相当快的。中国农科院植保所（IPP）在这里面贡献了将近一半。所以我们在新基因的发掘上，我们取得了非常好的进展。什么叫新基因？不是自己说了算的，要经过国际苏云金芽孢杆菌基因命名委员会的命名，也就是说我们这组数字是来自于他们的统计。

　　这是农科院植保所植物病毒害国家实验室他们发现的33个基因里的一部分，这是这些基因的登记号和它们的结构等等。

　　下面我举一个例子，就是干预其中的一个基因就是Cry8，这个基因，过去大家知道，是对地下害虫非常有效。特别是搞植物保护的代表，大家都知道，在相当长时间里，我们非常重视地上害虫的控制，特别是大豆害虫防治，忽视了地下害虫的防治，所以最近几年地下害虫的发生是相当的严重。

　　就拿金龟子来讲，这是它的成虫，在我们国家危害比较大的金龟子种群，特别是在华北地区有四种，一种叫黄褐金龟子，一种叫铜绿金龟子，一种叫大黑金龟子，一种叫暗黑金龟子，生物农药对这些害虫没有办法。农科院植保所科技人员他们系统地查阅了这方面的资料，发现以往报道的一些基因还十分有限，对某些金龟因子没有效果，与河北农科院合作，首先建立了一个大规模饲养和进行生物测定的方法，金龟子的饲养是很麻烦的，他们已经把这个方法突破了。从我们搜集到的大量菌株里面，我们发现有一些菌株含有Cry8的基因，这个Cry8的基因里，我们运用了Pcr—rflp的手段，发现在菌株中有不同的基因，分别对刚才讲的那几种有效，过去国外发现CryA、B、C、D四种，它们现在又增加了E、F、G，包括可能最近要公布的H。这个就是8Ea基因克隆的过程，这个基因和以往报道的基因同源性差别很大，完全是一个新的基因，结构和功能有新的特点。

　　生物测定的结果表明，Cry8Ea特别是对暗黑金龟子有效，大家可以看到这个效果是非常明显的。

　　用类似的方法，到目前为止，他们找到了四种，这里面就是Cry8Ca2、cry8Ea1、cry8Fa1、cry8Ga1，特别是BEa1和8Fa1和Cry8Ga1这些已经申请了我们国际的发明专利。考虑到金龟子的防治，特别是它的幼虫在地下活动，怎么才能有效的提高它的防治效果，如果做成菌剂的话，可能有问题，因为在土壤里很难接触到它，所以后来我们尝试了用转基因的途径，把它转到植物里面去，看它能不能在植物里面长时间表达，所以我们就构建了一个植物的表达载体，特别是应用了一个根，只让它在根部表达，这样的话，金龟子就会致死。这个显示了我们室内实验室的结果，大家看到，这是转基因的烟草，所以我们拿它作为一种试材，这是有转基因的，没有转基因的很大的特点就是根系受到极大的破坏，而转基因的根系是完整的，在地上也有很大的差别，这个实验证明这条路子是可以走的。而且将来我们防治，可能主要是靠转基因来防治。

　　我想转入第二个例子，就是我们怎么样通过基因的遗传操作，来扩大苏云金芽孢杆菌制剂的杀虫范围。在这方面华中农业大学也是做了很多工作的。他们在克隆了第一个基因的基础之上，后来就通过基因的一个定向表达载体，把CryEaC10P20基因弄到一起，转到YBT1520，改造后对棉铃虫的防治有明显的提高，尽管是一个基因工程的微生物，但还是得到了我们国家基因安全委员会的批准，现在已经开始生产、应用。

　　植保所的科学家走了另外一条路，他们把对鞘翅目BT基因和鳞翅目BT的基因连在一起，BT22是对鞘翅目有效的，G03是对鳞翅目有效的。还使用了另外一个UV17是采用Cry1BA3，从这个图里面大家可以看到，这个图鞘翅目有效的基因蛋白是方形的，在新的基因里面有方形的。对鳞翅目有效的晶体是菱形，同样有菱形的基因。这个里面同样含有两种不同形状的蛋白基因，说明这个转化是成功的。进一步的生物测定，也表明新的菌株对棉花棉铃虫、夜蛾效果都很好，无论室内或者是田间实验都有非常好的效果，扩大了杀虫的范围，这个是田间实验，对夜蛾都有很好的作用。

　　马铃薯甲虫是一个外来入侵的生物体，这几年在不断的蔓延，对马铃薯对茄科植物都是一个很大的威胁。

　　下面我再转入第三个例子，就是我们把BT基因转入我们国家的重要作物——棉花，培育抗虫棉。我想抗虫棉这几年在各个媒体上，或者各个方面讲得很多了。我今天主要是想借这个日子再进一步的谈一下苏云金芽孢杆菌基因操作、基因改良对我们农业生产上能起多大的作用，从这个例子可以看得更清楚。

　　这是棉铃虫，是咱们在三大农业棉区的一个主要害虫。曾经在90年代，造成巨大的危害。现在，当然有了很好控制，可是并没有绝禁，还是生产上一个重要的病虫对象。中国农科院生物技术研究所为主的科研单位，他们把苏云金芽孢杆菌Cry1A作了改良，同时考虑把这个基因和另外一种基因，叫做豇豆与蛋白酶制剂，做成一个双架的基因，通过高效的植物表达载体，把它导入棉花，棉花转化的过程非常有中国特色，就是所谓的花粉管导入方法。它的具体操作是在棉花开花后16个—24个小时之间，当棉花花瓣已经开始变色时，把花瓣去掉以后，露出幼嫩的子房，把我们已经构建好的基因转化表达的载体，打入幼嫩的子房，这样，基因就在它的胚囊发育过程中和它的生殖细胞整合。

　　当然我们同时用了国际上通用的农杆菌转化法，都得到了非常好的抗虫作用。大家看到，这个效果是非常明显。这张图是1994年照的，很长时间了。1994年在中国农科院植保所第一次实验证实我们中国的转基因棉花成功了，所以这个事件非常重要，以后从1997年开始，我们国家开始大面积的推广应用转基因棉花。1998年这项工作获得了我们国家的发明专利。应该说中国的抗虫棉是在和跨国集团激烈的高技术竞争中，克服了重重困难，在国家大力支持下，在广大农民的大力支持下，发展起来的。所以它的发展势头是非常强劲的。

　　大家看到，到2005年，我们整个登记的品种有46个，这几年还有很大的增加。整个推广应用面积已经占到我们整个棉花面积的66%。累计推广面积已达到850万公顷。就减少农药使用来讲是26万吨，效益已经超过了42亿美元。这个数字是国际上都引用的。除了抗虫棉花以外，我国国内很多科学家在抗虫水稻和抗虫玉米研究中也都取得很多骄人的成绩，今天我没去大会堂，张启发院士也做了报告，我想他可能也涉及到这一问题。

　　这是对于水稻的害虫过去主要靠化学农药，在南方水稻田里工作过的人都有体会。7、8月大热的天，深一脚、浅一脚背着喷雾器一天顶多打一亩半——两亩，工作量大不用说，还造成了很大的环境污染。现在把苏云金芽孢杆菌抗虫基因转到水稻里面去，就大大减少了农药的使用。

　　这就显示了刚才谈到的把1A基因转到水稻杂交稻里面，效果非常明显。

　　这里面有一张使人印象更深的照片，这是福建农科院拍的，这是在同一块稻地，同一个角度拍摄的，区别只是时间不同。从6月24—7月31号，事先这块实验地是设计好的，就是把转基因的水稻和没有转基因的水稻交互种植，就像一个棋盘一样，随着虫害不断的加剧，开始是绿油油的的水稻田，最后看不出来。抗虫的水稻和不抗虫的水稻截然不同，这张照片在国际会议上显示以后，外国人要求“我能不能够留下来”。这太有说服力了。

　　当然转基因水稻到目前为止，我们国家还没有正式批准应用，还有一些安全性的评价，要继续的深入进行。不过转基因水稻一旦能够应用，我想这对我们国家的农业生产，将会比抗虫棉起到更大的推动作用。

　　最后我想利用五分钟的时间，再谈一下转基因生物安全。

　　这个话题很大，也很敏感，大家也非常关注。用5分钟的时间，估计说不清楚，不过我想，我们在座的都是科技人员，这个问题一点就透。所以大家可能很容易理解。

　　转基因生物安全包括转基因食品安全，大家是非常关注的，也是我们这个分会场的主题之一。应该说我们国家对转基因生物安全是非常重视的，我们在世界上比较早建立了转基因生物安全法规和管理体系，全面开展了生物安全评价研究，转基因棉花和水稻的环境安全性评价研究走在国际前列。我们已经建立并逐步完善了转基因食品毒性和过敏性研究方法和实验体系，已经获得了大量科学的、具有说服力的实验的证据。转基因的成份快速检测技术已经实用化。也就是说对转基因生物安全问题上，我们国家投入很大的力量，包括我们的科学家取得了很大的成绩。

　　就苏云金芽孢杆菌来讲，它有没有安全性的问题呢？我想从科学的角度，我们应该注意这么几种实际情况。苏云金芽孢杆菌制剂已经有60年的应用历史，抗虫的转基因植物的种植也超过10年。据2005年统计国际上有18个国家在种植抗虫作物，总面积已经达到2630万公顷。可以说，到现在为止，没有任何证据说明其中的杀虫蛋白基因对环境和人类健康产生不良影响。什么道理？很简单，在哺乳动物里面肠壁细胞没有晶体蛋白受体，而且肠道环境呈酸性，杀虫蛋白无法发挥作用。从技术角度看，转基因育种与传统育种方法不一，本质相同。在严格管理的前提下，被允许转移的基因结构功能明确，一般没有风险，去除载体中的无关片段，更能确保安全。

　　可是，尽管如此，以绿色和平组织为代表的一些人还在不断地讲你的抗虫有问题，抗虫棉有问题，影响环境安全。抗虫水稻问题更大，不知道有没有人注意到，就在上周，欧盟又发动了新的一种技术，借口在欧盟的三个国家检测到中国转基因水稻的成份，在出口到欧盟的米粉（粉丝）检测到的。咱们且不说是不是检测到了，就安全性来讲，我觉得根据刚才讲的结论是清楚的，所以假设它是不安全的，你不断的制造或者宣扬或者拿出这样的数据我觉得是没有说服力的。我想转基因作物在今后发展过程中，还会碰到各种各样的争议，这个争议的背景是复杂的，可是这个发展的势头是不可逆转的，我们国家在中长期发展规划和“十一五”规划纲要里都明确提到16个问题，这是关系到我们国家未来经济和社会发展的重中之重，其中有一个专项，就是转基因生物新品种的培育，它提到要开发功能基因克隆与验证、规模化转基因操作等核心技术，建立和完善优异种质创新、新品种培育和规模化制种三大技术平台。

　　从世界情况来看，生物产业化趋势大家看到就在争议之中，从1996年不断上升，面积不断的扩大，到2005年已经达到9100万公顷，比起1996年来讲，面积增加了53倍，可以说近一个世纪以来，还没有一个生物技术有这样大的生命力。

　　最后我想借这个机会，感谢我们国内对苏云金芽孢杆菌遗传改良作出贡献的各位科学家，他们主要是农科院生物技术所、农科院植保所、河北农科院、华中农业大学、武汉科诺生物技术公司、中山大学、中国科学院、福建农科院等还有很多人做了这项工作。

　　最后我要特别感谢我的伙伴，我们植保所的张洁、宋子明博士，还有我们生物技术所的同事，还有参与这项工作的研究生和工作人员，谢谢大家。